Dış Kaynaklı Proje Süreçleri Yönetim Sistemi
Bu proje ile farklı fizyolojik ya da patolojik durumlarda indüklenen üç fosfolipaz enzim aktivitelerinin ilk defa ?eş zamanlı? olarak belirlenebilmesi amaçlanmaktadır. YPİTK ile üç enzimin aktivitesi eş zamanlı ölçülebildiğinde, herhangi bir doku, organ ya da biyolojik sıvıda herhangi bir ön ölçüm yapmadan, direkt olarak, hangi fosfolipaz yâda fosfolipazların aktivitesinin değiştiği çok daha ekonomik ve pratik bir şekilde tespit edilebilecektir.Fosfolipazlar, fosfolipitleri parçalayan enzimlerdir ve fosfolipaz aktivasyonu lipid mediyatörlerin üretiminde ve farklı hücre tiplerinde hücre içi sinyal iletim yoluna başlamasında temel bir adımdır. Fosfolipaz A2, serbest yağ asiti ve 1-açil lizofosfolipid üretir. Fosfolipaz C, gliserofosfat bağlarını parçalayan fosfodiesteraz olarak sınıflandırılır ve diaçilgliserol üretir. Son olarak, fosfolipidin baş grubu fosfolipaz D tarafından koparılıp fosfatidik asid açığa çıkar. Sonuçta fosfolipazlar hücre sinyallerinin çoğunu kontrol eden sayısız fosfolipid yıkım ürünü oluşturur. Yüksek performans ince tabaka kromatografisi, son yıllarda kullanıma hazır ticari plakaların yaygınlaşması ile fosfolipid sınıflarının eş zamanlı profillemesinde kullanılabilen ucuz, tekrarlanabilirliği yüksek, hassas ve etkili bir kromatografi haline gelmiştir. YPİTK ile hem fosfolipidler hem de farklı fosfolipaz sınıflarının etkisiyle bu fosfolipidlerden oluşan farklı yıkım ürünleri (ör. SYA, DAG ve FA) de aynı anda analiz edilebilmektedir. Enzim aktivitesinin ölçümünde genellikle enzimatik aktivite sonucu azalan substrat, açığa çıkan son ürün yâda substrat/ürün oranı ölçülmektedir. Her üç FLaz enziminin de substratı olan FK ile her üç parçalanma ürününün de aynı anda, aynı YPİTK plakası üzerinde tespit edilebilmesi nedeniyle bu projede fosfolipaz A2, C ve D enzim aktivitelerinin eşzamanlı ölçümünde YPİTK kullanılabilirliği değerlendirilecektir. Öncelikle farklı konsantrasyonlarda floresan işaretli fosfatidilkolin kullanarak YPİTK metodunun tespit limitleri ve geçerliliği ortaya konacaktır. Sonrasında 1 U FLA2, 1 U FLC ve 1 U FLD enzimleri ile 0-400 nmol NBD-FK, 37oC? de ayrı ayrı inkübe edilerek substrattan dakikada açığa çıkan nmol ürün miktarları tespit edilecektir (Aktivite,nmol/dakika). Daha sonra hem standart fosfolipaz solüsyonları hem de üç farklı kanser hücre hattında (Akciğer, Kolon, Pankreas) hem florometrik YPİTK hem de fosfolipaz ölçümünde en yaygın metod olan florometrik mikroplaka yöntemi ile FLA2, FLC ve FLD enzim aktiviteleri belirlenecektir. Elde edilen verilerin analizinde regresyon yaklaşımı kullanılacaktır ve validasyon işleminde florometrik mikroplaka metodu ?referans metod?, floresan YPİTK ise ?test metod? olarak kullanılacaktır. Temelde bu proje ile farklı fosfolipaz enzim aktiviteleri çok daha ucuza ve çok daha fazla sayıda örnekte belirlenebilecektir. Diğer yandan, lipid metabolizmasında aktiviteleri kolayca ölçülemeyen yâda ticari test kiti bulunmayan ?diaçilgliserol lipaz? gibi enzimlerin yâda kolesterol, glukoz, fruktoz, pirüvat gibi anahtar substratları kullanan ve farklı anabolik ya da katabolik yollara ait enzimlerin aktiviteleri floresan substrat kullanılarak YPİTK ile eş zamanlı ölçülebilecektir. YPİTK plakaları ve gerekli solventlerinin bulunduğu bir laboratuvarda, fosfolipaz enzim aktivitesi ölçülmek istendiğinde sadece substrat alınarak enzim aktivite analizleri gerçekleştirilebilecektir. Ayrıca malzemelerin tamamı göz önüne alındığında YPİTK yöntemi ile enzim aktivitesi ölçmek ülkemizi ?enzim aktivite ölçüm kiti üreten? bir kaç yabancı ülkeye bağımlılıktan kurtaracaktır. YPİTK yöntemi ile enzim aktivitesi ölçümünden artan plakalar ve solventler, sadece eksik solventler ve ilgili standartlar temin edilerek,temin edilerek,temin edilerek,temin edilerek,temin edilerektemin edilerek,temin edilerek, steroidler, nötral lipidler, fosfolipidler, safra asidleri, biyojenik aminler, fenolikler, ve aminoasidler gibi farklı bileşiklerin kromatografik analizlerinde kullanılabilecektir.